هرچند او بیشتر به شعر و ادبیات علاقه مند شد، آموزش موسیقی خود را رها کرد، اما آگاهی از جنبه های شنیداری زبان به خوبی در سبک دلپذیر نوشتن او منعکس شد.

در سال 1921، زمانی که خانلری هنوز در دبیرستان تحصیل می کرد، توسط فرامرزی تشویق شد تا یکی از تکالیف مدرسه خود را به عنوان مقاله برای روزنامه «اقدام» که توسط عباس خلیلی منتشر می شد، ارائه دهد. این آغاز فعالیت ادبی خانلری بود. به زودی اشعار او در مجلات ادبی معروف آن دوره به چاپ رسید (خانلری، 1369، ص 431-33؛ متینی، 1347، ص 243). نیما یوشیج بود که توجه خانلری را به زیبایی شناسی و تصویرسازی شعر فرانسه جلب کرد. اما تأثیر نیما بر تخیل ادبی او کوتاه مدت بود. اینکه آنها بعداً در تمایلات سیاسی خود به شدت با هم تفاوت داشتند، ممکن است توضیحی برای بیگانگی تدریجی آنها باشد (خانلری، 1370 الف، ص 447-59؛ زرین کوب، 1371، ص 406).

اولین اثرخانلری، ترجمه فرانسوی کاپیتانسکایا دوچکا (دختر ناخدا، 1836) اثر الکساندر پوشکین (1799-1837) بود که در سال 1931 با نام «دختر سلطان» منتشر کرد. نسخه اصلاح شده این رمان با عنوان «دختر سروان» در سال 1959 منتشر شد.

خانلری در سال 1932 در دارالمعلمین تهران ثبت نام کرد و برای امرار معاش به تدریس ادبیات فارسی در دبیرستان های متعددی ازجمله تمدن و فیروز بهرام پرداخت. دبیرستان فیروز بهرام یکی از قدیمی ترین دبیرستان های تهران واقع در خیابان جمهوری فعلی،کوچه میرزا کوچک خان که توسط نیکوکار پارسی، بنام بهرامجی بیکاجی در سال 1390 تأسیس شد.  (خانلری، 1369، ص 434؛رستگار فسایی، ص 19).

او در سال 1334 با رتبه برتر کلاس در رشته ادبیات فارسی فارغ التحصیل شد و در همان سال خدمت سربازی خود را آغاز کرد و بخشی از زمان خدمت خود را در رشت به تدریس پرداخت.

او در دانشکده تربیت معلم به پروفسور یان ریپکا (۱۸۸۶-۱۹۶۸)، محقق اهل کشور چک، ایران‌شناسی که در ایران به تحقیق مشغول بود، معرفی شد. خانلری به ریپکا کمک کرد تا فارسی مدرن خود را بهبود بخشد و ریپکا او را با گروهی از روشنفکران جوان، از جمله بزرگ علوی، مجتبی مینوی (1977-1903) و مسعود فرزاد که در کشمکش با سنت گرایان بودند، آشنا کرد. دانش جویان ادبیات فارسی اعضای این حلقه روشنفکری همگی چند سالی را در اروپا گذرانده بودند و از طرفداران مدرنیسم ادبی بودند. آن‌ها بیشترشب‌ها در کافه فردوسی یا کافه نادری در مرکز تهران با انتقاد شدید از نهاد ادبی سنتی به عنوان غذای اصلی گفتگویشان گردهم  می‌آمدند.  (خانلری، 1369، ص 437؛ مینوی، ص 357-60). خانلری به اعتراف خودش در تیررس این مناظره گرفتار شد و سعی کرد در بین دو اردوگاه متخاصم موضع مشخصی را حفظ کند.

خانلری در سال 1320 در مقطع دکتری ادبیات فارسی دانشگاه تهران ثبت نام کرد و در سال 1332 جزء اولین گروه دریافت کنندگان دکترای زبان و ادبیات فارسی بود که از دانشگاه تهران فارغ التحصیل شد. مشاور وی، بدیع الزمان فروزانفر بود که به همراه محمد تقی بهار( ملک الشعرای بهار) و سید محمد تدین کمیته بررسی دفاع از خانلری را تشکیل دادند.

پایان نامه او با عنوان «تحول غزل در شعر فارسی» بود که با راهنمائی ملک الشعرای بهار به انجام رسانید. این پایان نامه با انتقاد بدیع خانلری در بررسی عروضی شعر فارسی در سال 1948  با عنوان «تحقیق انتقادی در عروض و قافیه و چگونگی تحوّل اوزان غزل فارسی» منتشر شد و مورد استقبال منتقدان قرار گرفت.این بدعت اگرچه از نظرفروزانفر، جالب توجه است، اما همسر خانلری، زهرا کیا، آن را یک اثر ادبی می‌دانست. خانلری به خواندن و تحقیق خود در زمینه زبان شناسی مدرن ادامه داد و در سال های بعد آثار بیشتری در زمینه جنبه های قافیه و ریتم منتشر کرد.

خانلری در سال 1941 با زهرا کیا، دانشجوی دوره دکتری دانشگاه تهران ازدواج کرد. وی نخستین زن ایرانی بود که از دانشگاه تهران به دریافت درجه دکتری در رشته ادبیات فارسی نایل آمد. او بعداً در همان دانشگاه، مقام هیئت علمی را به دست آورد و به عنوان یک محقق ادبی ظهور کرد. پدرش میرزا هادی کیانوری است و زهرا کیا، نوه شیخ فضل الله نوری، روحانی برجسته ای بود که علیه جنبش مشروطه مبارزه کرد و در سال 1909 به اعدام محکوم گردید.

 خانلری و کیا دو فرزند داشتند: یک دختر بنام ترانه (متولد 1946) و یک پسر به نام آرمان (1951-1959)، که در هشت سالگی بر اثر سرطان خون درگذشت. این اتفاق تأثیر مخربی بر خانواده ناتل خانلری داشت. خانلری تعدادی از اشعار خود را به یادش منتشر و به او تقدیم کرد. خانلری در خردسالی فرزندش، مقاله‌ای تکان دهنده در قالب کتابچه راهنمای پند و اندرز، به پسرش با عنوان نامه به پسرم منتشر کرد. (هفتاد سُخن  دوم، ص 389-93).

خانلری فرزندش را به ضرورت مبارزه با دیو فساد در ایران سفارش و او را تشویق کرد تا خود را به دانش عمیق فرهنگ فارسی مجهز کند. این نامه خلاصه‌ای شیوا از آرمان‌های او در مورد ایران و راهی است که کشور برای بازیابی احترام و عزت بین‌المللی باید طی کند.

دکتر ناتل خانلری در سال 1943 به سمت استادیار (دانشیار) ادبیات فارسی دانشکده ادبیات دانشگاه تهران منصوب شد (افشار،1376 ب، ص 36). اگرچه خانلری تا آن زمان چندین شعر منتشر کرده بود و در محافل علمی و ادبی شهرت قابل توجهی به دست آورده بود، اما در سال 1942 (1342 هجری شمسی) معروف‌ترین شعر او، «عقاب» در مجله مهر منتشر نشد. شعر فارسی بزرگ قرن بیستم – که در محافل ادبی آن زمان به شهرت بالایی دست یافت (الهی، 1386، ص 54).

در سال 1942 انجمن فارغ التحصیلان دانشکده تربیت معلم تصمیم گرفت مجله ای از خود منتشر کند و خانلری را برای این کار تعیین کرد. اما چون خانلری هنوز به سن قانونی برای این انتصاب نرسیده بود، از ذبیح الله صفا (1911-1999) خواسته شد که صاحب امتیازی این مجله را به نام خود ثبت کند و برای گرفتن این مجوز اقدام کند. این مجوز در مارس 1942 به صاحب امتیازی ذبیح الله صفا و سردبیری دکتر خالری صادر شد و شماره اول با عنوان ماهنامه به چاپ رسید (بولتن انجمن لیسانسه های دارالمعلمین)و در ژوئن 1943 منتشر شد (سلامی و روستایی، اسناد مطبوعات ایران سوم ص 585). متعاقباً، زمانی که سن خانلری دیگر مطرح نبود، مجله سخن از شماره دوم سال نخست به عنوان یک مجله مستقل به صاحب امتیازی و سردبیری ناتل خانلری شروع به انتشار کرد (افشار، 1392، ص 207؛ خانلری، 1369، ص 436؛ ایدم، هفتاد سُخُن اول، ص 10).

سردبیری خانلری در مجله سخن با وقفه هایی، 35 سال به طول انجامید. مجله سخن که بسیاری از شخصیت‌های مهم فرهنگ و ادب فارسی آن زمان، به آن کمک می کردند، در آشنایی خوانندگان با ادبیات بین‌المللی، به‌ویژه با شعر فرانسه، نقش بسزایی داشت. رویکرد نوآورانه خانلری نسبت به ادبیات فارسی، به‌ویژه شعر مدرن، فرصتی را برای بسیاری از شاعران جوان اعم از صادق هدایت و بزرگ علوی (پدران داستان‌نویسی نوین ایرانی) به همراه حسن شهید نورایی، نویسنده و استاد دانشگاه، فراهم آورد که تا آن زمان از انتشار آثارشان محروم شده بودند، در شماره نخست به چاپ برسد. (متینی، 1370، ص 234؛ الهی، 1369، ص 14-17؛ نگاه کنید به زیر، شعر).

خانلری در سال 1946 از سوی علی اکبر سیاسی، رئیس وقت دانشگاه تهران، به عنوان مدیر انتشارات تازه تأسیس دانشگاه تهران با عنوان دفتر انتشارات و روابط فرهنگی منصوب شد. در این مدت خانلری نیز در انتشار مجموعه‌ای از شاهکارهای ادبیات فارسی به ذبیح الله صفا پیوست. اینها شامل نسخه‌های خلاصه شده ادبی و گزیده‌ای از ادبیات کلاسیک‌ فارسی در کتابچه‌های شومیز همراه با واژه‌نامه‌های توضیحی کلمات یا عبارات دشوار بود. به پیشنهاد او، کمیته‌ای به نام انجمن تألیف و ترجمه برای انتخاب آثار یا ترجمه‌های اصلی تشکیل شد تا توسط انتشارات دانشگاه تهران منتشر شود.

نخستین کنگره نویسندگان ایران یکی از مهم‌ترین رویدادهای فرهنگی و هنری دوره دههٔ بیست ایران بود که نقش بارزی در جریان نوین ادبیات و نثر فارسی داشت. این کنگره در سال 1946 به دعوت انجمن روابط فرهنگی ایران و شوروی و با شرکت 78 نفر از نویسندگان، شاعران و محققان ایرانی برگزار شد. خانلری مقاله‌ای درباره تحولات معاصر در نثر فارسی خواند و شرحی تاریخی از سبک‌ها و ژانرهای مختلف نثر از جمله سفرنامه، روزنامه‌نگاری، ترجمه، رمان، نمایشنامه و نقد ادبی ارائه کرد. وی از سانسور دولتی در گذشته به شدت انتقاد و اشاره کرد که نویسندگان معاصر باید سعی کنند نوشته های خود را با دنیای مدرن تطبیق دهند (قیصری، ص72؛ قنون پرور، ص 153؛ علوی، 1363، ص25). این گردهمایی با همدلی‌های چپ‌گرایانه‌اش، محفلی برای پخش دیدگاه‌های مختلف و مخالف فراهم نمود که به توسعه ادبیات انتقادی در ایران کمک کرد.

در سالهای پرآشوبی که قبل از شورش تجزیه طلبان تحت حمایت شوروی در آذربایجان، در سال 1945 انجام شد، بسیاری از روشنفکران آن زمان، از جمله خانلری، خود را در درجات مختلف در همدردی با جنبش چپ که حزب توده نمایندگی می کرد، دیدند. اما سقوط جنبش جدایی طلب مورد حمایت شوروی در آذربایجان و آزادسازی استان توسط نیروهای نظامی ایران در دوره نخست وزیری قوام السلطنه در سال 1946 به چنین همدردی برای اکثریت عظیم مردم پایان داد. خانلری با انعکاس حال و هوای آن زمان در مقاله ای مفصل در مجله سخن با عنوان «لهجه ها و زبان ها» (گویش ها و زبان های محلی، سخن 3/2، 1946، ص 81-87)، استدلال کرد که یک کشور نمی تواند پیشرفت اجتماعی و رشد آموزشی را تجربه کند مگر اینکه دارای وحدت ملی، فرهنگ مشترک و زبان مشترک باشد (ابراهامیان، ص 407-8).

خانلری در 1947 به فرانسه رفت و دو سال را در « انستیتو دو فونتیک » وابسته به دانشگاه سوربن به تحصیل، پژوهش و مطالعه درحوزه زبان و آوایی شناسی گذراند (نک : Duchesne-Guilleman, p. 46). او نخستین ایرانی‌ای بود که با رشتهٔ فونتیک (آواشناسی ) در این مؤسسه آشنا شد و رساله‌ای نیز در این مورد به زبان فرانسوی نوشت. وی قصد داشت این رساله را با نام «آواشناسی زبان فارسی» به عنوان رساله دکتری خود به این مؤسسه بفرستد، اما او با منصرف شدن از سوی اساتیدی که معتقد بودند مدرک رسمی کمک چندانی به جایگاه خانلری در حوزه زبان شناسی و شهرت او نمی کند، از ارائه آن خودداری کرد (خانلری، 1990، ص 447؛ ملاح، ص 398-99؛ رجوع کنید به همچنین، پارسی‌نژاد، 1392، ص 299-302). در سال 1350 برای اولین کرسی تاریخ زبان فارسی در دانشگاه تهران تأسیس شد و خانلری به عنوان نخستین صاحب کرسی آن منصوب شد. ایشان در سال 1953 برای تدریس دروسی در دانشگاه سنت جوزف بیروت دعوت شد و چند ماهی را در لبنان گذراند.

خانلری دوست صمیمی اسدالله علم (1919-1978) بود، علم یکی از شخصیت‌های کلیدی سیاسی در دوران سلطنت محمدرضا شاه پهلوی بود که از سال 1962 تا 1964 نخست‌وزیر ایران شد، این دوستی تا زمان مرگ علم در سال 1978 ادامه یافت (بهزادی، ص 145-46).

پدربزرگ علم، امیر شوکت الملک علم، از مالکان بانفوذ اواخر دوره قاجار و اوایل دوره پهلوی است که والی قائنات و سیستان بود و روابط نزدیکی با میرزا خانلر خان اعتصام ‌الملک‌ داشت. علم در خاطرات خود مکرراً از خانلری به عنوان همکار و دانشمند بسیار محترم یاد می کند (علم ، یادداشته، پاسیم؛ همچنین رجوع کنید به شاهدی).

در شهریور 1343 بنیاد فرهنگ ایران با ریاست افتخاری ملکه فرح پهلوی، با مأموریت حفظ میراث فرهنگی ایران و ارائه دستاوردهای آن به سایر ملل راه اندازی شد. (1990، ص 358). خانلری در آبان 1343 به عنوان دبیرکل بنیاد منصوب شد. بنیاد متشکل از چهار بخش اصلی بود که هر یک توسط یک یا دو محقق اداره می‌شد و تعدادی از پژوهشگران ایران‌شناسی زیر نظر آنها کار می‌کردند (افشر، 1370، ص 656-57 ). انتشارات بنیاد به سرپرستی علی اکبر سعیدی سیرجانی (حدود 300 عنوان) محدود به کارکنان آن نبود، بلکه  آثاری از سایر علما را نیز شامل می شد. بنیاد از کار مراکز فرهنگی ایران در خارج از کشور حمایت می کرد و در سال 1972 برنامه ای را برای ترویج مطالعه زبان فارسی در کشورهای همسایه با ارائه کمک هزینه تحصیلی برای دانشجویان هند، پاکستان، ترکیه و مصر به اجرا گذاشت تا آنها را قادر به شرکت در دوره های تابستانی در کشورهای همسایه کند. همچنین ایران سمینارهای زبان و ادبیات فارسی را در شبه قاره هند برگزار کرد و در همان سال یک موسسه تحقیقاتی و پژوهشی با نام پژوهشکده فرهنگ ایران وابسته به بنیاد فرهنگ تأسیس کرد که دارای چهار رشته‌ی ادبیات فارسی، زبان‌های باستانی ایران ، زبان شناسی عمومی و تاریخ بود که دانشجویانی را برای تحصیلات تکمیلی پذیرفت.

خانلری در جلسات سالانه کنگره ایران شناسی که از سال 1970 به بعد توسط ایرج افشار، مدیر کتابخانه مرکزی و مرکز اسناد دانشگاه تهران برگزار می شد، حمایت و مشارکت فعال داشت. بسیاری از دانشمندان بین‌المللی در جلسات کنگره شرکت کردند و زمینه آشنایی دانشجویان و دانش پژوهان جوان با تحقیقات جاری در زمینه‌ها و کشورهای مختلف فراهم شد (افشار، 1997 ب، ص 41، باگلی، ص 90-94).

در سال 1967 خانلری به عنوان دبیرکل کمیته ملی مبارزه با بی‌سوادی (کمیته ملی پیکار با بی‌سوادی) منصوب شد. او که از مداخله و مداخلات ناروا از اقشار مختلف مأیوس شده بود، در سال 1970 از سمت خود استعفا داد (خانلری، 1370 ب، ص 468-76). در طول دهه 1970، خانلری به طور فزاینده ای درگیر وظایف اداری بود و زمان زیادی را در ظرفیت های مشاوره، جلسات تشریفاتی و بازدیدهای رسمی گذراند.

اظهارات صریح خانلری پس از آزادی از زندان درباره درگیری‌هایش با ساواک، بار دیگر حکایت از بهای گزافی دارد که او برای وفادار ماندن به آرمان‌های فکری خود از یک سو و خدمت به کشور و فرهنگی که بسیار دوستش داشته است، پرداخته است. از سوی دیگر او در مقاله‌ای با عنوان «دام بد نامی» خاطرات تلخی را از مهرداد پهلبد، وزیر فرهنگ و هنر وقت، یاد آور می شود که او را درگیر سانسور دولتی می کند. خانلری همچنین توصیف می نماید که دیوانه وار با آن طرح پیچیده و از قبل چیده شده مبارزه کرده است. (خانلری، 1370 ب، ص 469-77؛ همچنین رجوع کنید به علوی، 1376، ص 27).

در فروردین 1358، اندکی پس از انقلاب اسلامی، خانلری دستگیر شد و سه ماه را در زندان اوین سپری کرد و هر روز را در عذاب تهدید به اعدام به سر می برد‌. چندین روایت متناقض و تا کنون بی‌اساس درباره تلاقی وقایعی وجود دارد که ممکن است در آزادی او نقش داشته باشد. بر اساس یک روایت فتح الله مجتبایی، دوست و همکار خانلری در مجله سخن، از روحانی بسیار با نفوذ مرتضی مطهری (1979-1920)، استاد دانشکده الهیات دانشگاه تهران و رئیس انقلاب تازه تأسیس، درخواست آزادی خانلری را نموده است(جعفری، دوم، ص 799). همچنین گفته می‌شود که سعیدی سیرجانی، دستیار خانلری در بنیاد فرهنگ ایران، از مظفر بقایی کرمانی خواسته بود که از طریق شاگرد بانفوذ خود حسن آیت که در حزب جمهوری اسلامی سمت بالایی داشت، برای آزادی خانلری از نفوذ خود استفاده کند (به نقل از تعدادی از دوستان نزدیک خانلری).

خانلری پس از آزادی از زندان، با سلامتی شکننده و در تقابل با تشکیلات جدید، سال های بسیار سختی را پشت سر گذاشت. با این حال، علیرغم پیشنهادهای مکرر گروه های سلطنتی در تبعید برای ترتیب دادن سفر امن خود به اروپا، او از ترک وطن خودداری کرد (متینی، 1991، ص 236؛ میلانی، ص 977). همانطور که در نامه مذکور خطاب به پسرش  قبل از مرگ نابهنگام او در سنین کم نوشته بود، از آن نوع گیاهی نبود که به راحتی در خاک دیگری شکوفا شود (متینی، 1370، ص 237). (منظور این است که فقط در خاک وطن استعداد خانلری شکوفا می شود).

او که از بیماری پیشرونده پارکینسون رنج می برد، روزهای پایانی زندگی خود را در گوشه نشینی، خواندن و نوشتن و گاهی پذیرایی از دوستان و همکاران قدیمی گذراند. از طرفی تحقیر در زندان و از طرفی دیگر وضعیت جسمانی وخیم‌تر ایشان، باعث شکست روحیه مصمم او شد. عمل جراحی لگن و به دنبال آن بدتر شدن استخوان های شکسته، آخرین ماه های زندگی او را پر از عذاب و درد کرد (میلانی ص 977).

دکتر پرویز ناتل خانلری این سیاستمدار فرهیخته، شاعر و نویسنده عالی مقام و به حق ایرانی دانشمند وطن خواه، در 23 اوت 1989 چشم از جهان فرو بست و در بهشت زهرای تهران، قطعه 73، ردیف 30، شماره 66 آرمید. خانلری را باید در حکم ناجی یکی از ارکان ملیت ایرانی در سده اخیر دانست. همسر همیشه همدل و همراه ایشان دکتر زهرا کیا (خانلری) نیز شش ماه بعد از فوت ایشان به دیار باقی شتافت و در جوار همسر خویش به خاک سپرده شد.

خبر درگذشت او باعث برانگیختن ارزیابی ها از زندگی و کار او شد. مجله ایرانشناسی که در آمریکا منتشر می شد، شماره ویژه ای را با مقالاتی از چند تن از محققان برجسته تاریخ و ادبیات ایران به او اختصاص داد. دو جلد یادبود به افتخار وی منتشر شد: